Prístroj, ktorý triedi bunky podľa veľkosti a farby

Autor: Mária Džunková | 15.3.2013 o 0:18 | (upravené 15.3.2013 o 18:34) Karma článku: 9,74 | Prečítané:  2377x

Predstavím vám jeden veľmi zaujímavý prístroj, ktorý dokáže triediť bunky podľa veľkosti a farby. Volá sa cytometer. V genetickom výskume sa teší čoraz väčšiemu záujmu, pretože nám umožňuje pracovať s jednodlivými bunkami, ktoré nám rozdelí do oddelených túb podľa nášho želania. Pomáha napríklad aj v diagnostike rakoviny. A nám mikrobiológom slúži napríklad na triedenie špecifických skupín baktérií.

Takto zachytáva cytometer fluorescenciu. Na tomto obrázku je vidieť dve oblasti (akoby obláčiky). Tá, ktorá je vyššie, vyžaruje požadované svetlo. Negatívna vzorka by mala len tú nižšiu oblasť.Takto zachytáva cytometer fluorescenciu. Na tomto obrázku je vidieť dve oblasti (akoby obláčiky). Tá, ktorá je vyššie, vyžaruje požadované svetlo. Negatívna vzorka by mala len tú nižšiu oblasť.Mária Džunková

To, ako funguje, vysvetlím na príklade s baktériami z našeho laboratória. Genómy väčšiny baktérií, ktoré žijú v ľudskom tráviacom trakte, sú už známe. Na to, aby mám cytometer pomohol vyseparovať nejaký konkrétny druh baktérie, musíme najprv nájsť v jej genóme sekvenciu o dĺžke asi tak 20 písmeniek (nukleotidov), ktorá je autentická len pre túto našu baktériu a nemôže sa nachádzať v žiadnej inej. Takže počítač musí prejsť stovky genómov a vybrať jedinečnú sekvenciu typickú len pre našu baktériu. Väčšinou sa na takéto rozoznávanie využíva jeden ribozonálny gén, ktorý slúži na identifikáciu bakérií, ako keby to boli ich odtlačky prstov. Táto kratučká sekvencia o dĺžke 20 nukleotidov poslúži na vytvorenie fluorescenčnej sondy, ktorá bude mať sekvenciu komplemntárnu k RNA baktérie, ktorú chceme vytriediť. Túto sekvenciu-fluorescenčnú sondu si necháme vyrobiť vo firmách, ktoré majú akoby tlačiarne na DNA a vyrobia nám našu sekvenciu podľa objednávky.WP_000737.jpg

Okrem toho sa musíme rozhodnúť, aké flourescenčné farbivo k tejto sonde necháme pripojiť. Sú ich desiatky a každé z nich má svoju škálu, pri akom svetelnom spektre sa rozožiari. Pri objednávke sondy si vyberieme farbivo, ktoré dokáže zaznamenať náš cytometer, napríklad také, ktoré sa pri nasvietení laserom modrej farby rozosvieti na zeleno. Taký lepší cytometer má niekoľko rôznych kanálov, na ktorých detekuje rôzne farby svetla, ktoré vydá bunka po nasvietení laserom. Vďaka tomu môžeme robiť dokonca aj dve triedenia buniek naraz, teda triediť bunky naraz podľa dvoch vlastností. Musíme ale vybrať farbivá, ktoré pri nasvietení laserom svietia v odlišných farbách, napríklad jeden typ bunky bude svietiť na zeleno a druhý na červeno. Takto môžeme načerveno a nazeleno svietiace bunky triediť oddelene do dvoch túb podľa farieb alebo môžeme vyberať len tie bunky, ktoré budú svietiť obidvoma farbami naraz.

Experiment v laboratóriu začne tak, že baktérie zabijeme formaldehydom, ktorý ich zakonzervuje v takom momente, v akom boli pred smrťou. Takže ak sa bunka nachádzala v najlepšej fáze svojho rastu, tak ju zakonzervuje s práve najvyšším obsahom RNA, takže naša sonda bude mať veľa kópií RNA, kam sa môže komplementárne pripojiť. Toto pripojenie sondy docielime tak, že bunku najprv trocha natrávime enzýmami, aby do nej mohli preniknúť naše fluorescenčné sondy. Pri zvýšení teploty dôjde k pripojeniu sond k RNA. Potom nadbytočné sondy, ktoré sa nikam nepripojili, odmyjeme a môžeme preWP_000736.jpgjsť k triedeniu buniek na cytometri.

Cytometer pracuje obrovskou rýchlosťou. Nasáva bunky neuveriteľne rýchlo a usporiada ich jednu za druhou do tenučkého toku fyziologického roztoku. Každá bunka sa bude nachádzať v jednej kvapke tohoto roztoku. Cytometer dokáže za sekundu preskenovať 1000-3000 buniek. Každú z nich nasvieti svojim laserom, zmeria hodnoty fluorescencie na každej vlnovej dĺžke a tiež získa informácie aj o jej veľkosti. Tieto kvapky prúdia tak veľkou rýchlosťou, že keď ja pozorujem na obrazovke počítača, ako ich sníma kamera, tak sa mi zdá, že je to statický obrázok, kde sa prúd fyziologického roztoku pomaly rozdeľuje na kvapky. Pomocou počítača zadefinujeme, od akej hodnoty považujeme bunky za dostatočne fluorescentné. To určíme porovnaním s negatívnou kontrolou, ktorá obsahuje bunky pripravené rovnakým spôsobom, ale bez pridania flourescenčnej sondy. Negatívna kontrola je veľmi potrebná, pretože niektoré druhy baktérií totiž niekedy mierne svietia aj bez fluorescenčnej sondy.  Ak namerané hodnoty bunky vyhovujú našemu zadaniu, kvapka sa nabije negatívne a pritiahne sa k pozitívnemu pólu triediaceho zariadenia. Odtiaľ odkvapne do pripravenej tuby. Bunky, ktoré nevyhovujú (alebo vyhovujú inému zadaniu), sa pritiahnu k negatívnemu pólu a spadnú do druhej tuby.

Takto fyzicky oddelené bunky môžeme ďalej skúmať, napríklad vyextrahovať z nich DNA a sekvenovať. Cytometer má obrovské množstvo aplikácií. Napríklad, baktérie tráviaceho traktu môžeme triediť aj podľa aktivity, ktorá sa dá merať množstvom RNA. Tie, ktoré majú viac RNA, budú svietiť viac a cytometer ich vyseparuje. To sa dá aplikovať napríklad vtedy, keď chceme spoznať baktérie, ktoré našimi črevami len tak prechádzajú a nemajú žiadnu aktívnu úlohu. O tom nájdete viac tomto článku mojich kolegov. Okrem baktérií môžeme triediť napríklad aj chromozómy, o čom som písala v blogu o sekvenovaní pšenice. Dá sa vytriediť hoci len jedna jediná bunka či jediný chromozóm.

Cytometer nemusíme používať hneď na fyzické triedenie buniek. Kedže dokáže rozoznávať bunky podľa veľkosti, stačí, že doňho dáme vzorku krviniek a podľa odlišností v ich početnosti a tvarových odchyliek dokážeme diagnostikovať napríklad leukémiu už vďaka obrázku, ktorý sa nám ukáže behom niekoľkých sekúnd na obrazovke počítača.

 

 

 

 

 

Páčil sa Vám tento článok? Pridajte si blogera medzi obľúbených a my Vám pošleme email keď napíše ďalší článok
Pridaj k obľúbeným

Hlavné správy

KOMENTÁRE

Van der Bellen nevyhral, to len populizmus porazil sám seba

Miloš Zeman sa tešil predčasne. Ukazuje sa, že víťazstvá radikálov či populistov nie sú ani v dnešnej dobe samozrejmosťou.

KOMENTÁRE

Renzi dal sám sebe mat. Dostala ho aj Európa?

Taliansky výsledok je politicky nepomerne ďalekonosnejší než rakúsky.

SVET

Taliansky premiér Renzi po prehre v referende podá demisiu

Hlasovanie zaznamenalo vysokú účasť.


Už ste čítali?