Ako si namnožiť svoju DNA?

Autor: Mária Džunková | 3.8.2013 o 1:02 | (upravené 3.8.2013 o 1:24) Karma článku: 9,59 | Prečítané:  2734x

Laboratórne protokoly nie sú žiadna kuchárska kniha. Ak chceme úspešne urobiť nejaký pokus, musíme zistiť množstvo DNA, s ktorou budeme pracovať. Jej koncentrácia sa dá merať pomocou rôznych metód, ktoré vám v tomto blogu predstavím. Čo ale v prípade, ak je DNA na pokusy málo? Aj na to je riešenie. Môžeme si DNA namnožiť.

NanodropNanodropstiahnuté z openwetware.org/wiki/Luckau_Protocols:NanoDrop

DNA je vlastne kyselina, ktorá sa rozpúšta vo vode. Už sme si hovorili, že jedna molekula DNA je strašne dlhá (napríklad aj niekolko miliónov nukleotidov - písmen ATCG). U mnohých organizmov už poznáme, z koľkých písmen sa skladá táto ich strašne dlhá DNA molekula - genóm. Je známa aj všeobecná priemerná hmotnosť jedného nukleotidu, takže môžeme vypočítať, že v jednej bunke baktérie je asi 1.5 to 15 fg DNA. Fg je femtogram. Predstavte si kilogram múky. Toto je 1 000 000 000 000 000 000 menej.

Pri extrakčnom protokole sa nám ale DNA z bunky naláme na kúsočky, ktoré sú dlhé len niekolko stoviek ci tisíc nukleotidov. Okrem toho, asi žiaden laboratórny protokol na extrakciu DNA nie je schopný zabezpeciť 100% výtažok DNA, ktorá by sa v bunke mohla nachádzat. Takže nakoniec máme ešte menej než 1.5 to 15 fg DNA a k tomu je ešte nakrájaná na kúsky.

Koncentrácia DNA sa najbežnejšie meria pomocou prístrojov nanodrop a fluorometer. Nanodrop meria len absorbanciu svetla na 260 nm, ale nevie rozoznať veľmi dobre, či meriate DNA či RNA alebo nejaké iné zbytky niečoho špinavého. Do flourometru sa nanášajú vzorky DNA, ktoré sa predtým naviažu sa špeciálne flourescenčné farbivo, ktoré sa špecificky viaže na RNA alebo DNA. Takto je meranie oveľa presnejšie. Normálne však tieto prístroje nezvládnu merať koncentrácie nižšie než 1 nanogram DNA/ na mikroliter.

Samozrejme, pri priamej extrakcii DNA z výkalu, pracujeme s niekoľkými miliónmi baktérií, takže tam už nehovoríme o femtogramoch, ale o oveľa výšších hodnotách - o nano či mikrogramoch DNA. S takýmto výťažkom DNA môžeme spokojne pokračovať v akomkoľvek pokuse, pretože všetky ďalšie experimenty v laboratóricáh molekulárnej genetiky zvyknú začínať na niekoľkých mikrogramoch či stovkách nanogramov.

Občas však robíme aj špeciálne pokusy, pri ktorých triedime DNA pomocou prístroja cytometra, o ktorom som písala v minulom blogu a teda nepracujeme s miliónami baktérií, ale len so stovkami či tisíckami. Cytometer dokáže do skúmavky umiestniť také množstvo baktérií, aké mu zadáme. Napríklad 100 či 100 000. Niekedy nás zaujímajú len bunky s nejakými špeciálnymi vlastnosťami, ktoré v tomto prístroji po ožiarení laserom budú svietiť. Takže flourescentné baktérie prístroj vytriedi do jednej skúmavky a tie nesvietiace do druhej. A takto dostaneme len niekoľko stoviek či tisíc baktérií. Sú aj takí vedci - extrémisti, ktorí robia pokusy, kde im citometer vytriedi len 1-10 buniek. Čo potom s takým malým množstvom DNA?

V jednom predchádzajúcom blogu som vám vysvetľovala aj ako funguje reakcia PCR. Polymerázová reťazová reakcia. Pri tejto reakcii máme v skúmavke našu DNA, voľné písmenká - nuleotidy, enzým polymerázu v príslušnom roztoku a množstvo dvojích umelo nasyntetizovaných kúsočkov DNA (volajú sa primery), ktoré sú kompatibilné s istou sekvenciou našej DNA v skúmavke. Pomou zmeny teplôt sa docieli, že sa tieto primery prilepia na kompatibilné úseky originálnej DNA a potom enzým polymeráza doplní písmenká podľa predlohy originálnej DNA a vyrobí takto kópiu úseku, ktorý nás zaujíma. Takto sa jeden úsek DNA namnoží aj niekoľko biliónov krát.

Tu musím spomenúť ešte tretí zaujímavý spôsob merania koncentrácie DNA, ktorý je oveľa citlivejší než flourometer či nanodrop. Je to takzvaná real time PCR, ktorá v reálnom čase monitoruje počet kúsočkov, ktoré sa počas reakcie PCR vytvárajú. Meria flourescenciu, ktorá vzniká, keď sa vytvorí každá nová kópia nášho kúsočku DNA. Takto dokážeme vypočítať, koľko molekúl DNA nakoniec máme a koľko ich bolo na začiatku. Teoreticky sa môžeme dopočítať až k jednému jedinému kúsočku DNA, ktorý vážil niekoľko zeptogramov.

Reakcia PCR má ale jeden háčik. Môžeme ju použiť len v prípade, že vieme, akú dvojicu primerov si nechať vyrobiť, teda že musíme poznať genóm alebo aspoň jeho časť. V prípade identifikácie baktérií je to jednoduché, lebo tam môžeme namnožiť aj kúsok DNA z neznámych baktérií, ktoré nikto nikdy nekultivoval a ani možno nikdy nevidel. Všetky baktérie majú jeden zakonzervovaný gén. Takže si môžeme nechať vyrobiť univerzálne primery a pomocou PCR namnožiť úsek medzi touto dvojicou primerov. Takto odhalíme úsek DNA medzi týmito primermi aj u neznámych baktérií, aj keď sme ich nikdy nevideli.

Dá sa namnožiť aj celý genóm? V dnešnej dobe už áno. Existuje mnoho podobných postupov, sú založené hlavne na tom, že sa na DNA vyextrahovanú z nejakého organismu napoja náhodné primery. To znamená, že v skúmavke máme obrovské množstvo rôznych kombinácií primerov. Takéto primery môžu byť dlhé napríklad 6 písmen a obsahovať všetky kombinácie písmen ACTG. Tieto primery sa nalepia na našu DNA a tá sa pomocou špeciálnej polymerázy začne množiť. Výrobcovia tohoto enzýmu tvrdia, že z pár pikogramov DNA dokážu vyčariť niekoľko mikrogramov. Na nasledujúcom obrázku, ktorý som prevzala zo stránok Biocompare, je jeden príklad.

amer_gsv1.gif

Nie je všetko ale také jednoduché. Táto polymeráza môže náhodou preskočiť z jedného kúsku DNA na druhý a vyrobiť nejaký spojený hybrid. Alebo sa môže stať, že nejaké úseky originálnej DNA úplne vynechá, vôbec ich nenamnoží. A najhorší mix by nastal, ak by sa nám v skúmavke vyskytla nejaká nechcená kontaminujúca baktéria a polymeráza by preskočila z jednej baktérie na druhú, tak to by sme mali mix dvoch druhov a ich sekvencie nevedeli poriadne oddeliť. Alebo že by sa primery nejako nalepili na seba a vytvorili nejakú vymyselnú DNA.

Keď potom takýto umelo namnožený genóm budeme chcieť osekvenovať, teda spoznať sekvenciu genómu aj nejakej úplne neznámej baktérie, tak budeme nakoniec zhrození, že nám tam vychádza nejaký nezmyselný hybrid. Nejaké základy práce bioinformatikov nájdete v jednom z predchádzajúcich blogov.

Téme práce s veľmi malým množstvom DNA som sa venovala počas posledných mesiacov. Článok je už odoslaný, ale ešte nevyšiel, takže nebudem teraz ešte prezrádzať žiadne výsledky. Takže riešenia týchto minimalistických problémov až v nejakom budúcom blogu. Vy mi zatiaľ, prosím, držte palce, aby článok vyšiel čo najskôr a v čo najlepšom časopise :-)

 

Páčil sa Vám tento článok? Pridajte si blogera medzi obľúbených a my Vám pošleme email keď napíše ďalší článok
Pridaj k obľúbeným

Hlavné správy

KOMENTÁRE

Van der Bellen nevyhral, to len populizmus porazil sám seba

Miloš Zeman sa tešil predčasne. Ukazuje sa, že víťazstvá radikálov či populistov nie sú ani v dnešnej dobe samozrejmosťou.

KOMENTÁRE

Renzi dal sám sebe mat. Dostala ho aj Európa?

Taliansky výsledok je politicky nepomerne ďalekonosnejší než rakúsky.

SVET

Taliansky premiér Renzi po prehre v referende podá demisiu

Hlasovanie zaznamenalo vysokú účasť.


Už ste čítali?