Prírodná látka, ktorá zabíja len zlé baktérie

Autor: Mária Džunková | 15.10.2014 o 22:04 | (upravené 16.10.2014 o 10:14) Karma článku: 11,44 | Prečítané:  7331x

Tento týždeň nám v časopise Journal of Medical Microbiology vyšiel článok o tom, ako sme sledovali rast dvoch druhov baktérii pod vplyvom rastlinného alkaloidu 8HQ. Je to produkt výbornej spolupráce so stážistkami z mojej bývalej univerzity v Prahe. Aby ste vedeli, do Valencie sa nechodí len vyvaľovať sa pri mori, ale aj tvrdo makať.

Je už takým nepísaným zvykom, že študenti doktorátu chodia na skusy do sveta. Tak nám napísali Jitka a Šárka, že by chceli prísť ku nám na stáž. Jitka v Prahe skúmala rastlinný alkaloid 8-hydroxyquinoline (8HQ), ktorý má antibakteriálne účinky. Všimla si, že táto látka pozastavuje rast patogénnej baktérie Clostridium difficile, ale na druhej stranej necháva pokojne rásť priateľskú baktériu Bifidobacterium longum subsp. longum. Jitka sa snažila zistiť, aká je potrebná koncentrácia, aby Clostridium bolo zahubené a tiež či existuje vôbec nejaká koncentrácia 8HQ, pri ktorej Bifidobacterium už prestáva rásť tiež.

Tento druh výskumu nás veľmi zaujal, pretože na Fakulte tropického zemědělství, kde Jitka robila doktorát, skúmajú netradičné rastliny z tropických pralesov. Študenti chodia na prieskum do pralesa, rozprávajú sa so šamanmi a miestnymi ľudmi a oni im poradia, aké rastliny používajú na liečbu chorôb. Potom študenti tieto rastliny privezú do Česka a skúmajú, aké zaujímavé liečivé látky sa v nich nachádzajú. Môžu to byť látky, ktoré majú antibaktériálne účinky alebo veľmi vysoké antioxidačné účinky. Najlepsie je, ak sa nájde látka, ktorá nezabíja všetky druhy baktérií, ale presne len tie, ktoré potrebujeme zničiť, zatiaľčo tie zdraviu prospešné necháva rásť. Predstavte si napríklad, že by ste brali antibiotiká proti zápalu pľúc, ale tie by vám nepoškodili vaše priateľské črevné baktérie, k čomu pri normálnych antibiotikách dochádza.  



Úplne základný pokus na zistenie koncentrácie antibakteriálnej látky, pri ktorej sa už pozastavuje rast baktérií, je ten, že si do 96 jamkovej dostičky nanesiete zvyšujúce sa koncentrácie, pritom máte v každej jamke rovnaký počet baktérií. Počkáte niekoľko hodín (dní) a potom dáte dostičku do prístroja, pomocou ktorého určíte, koľko baktérií v každej jamke narástlo. Tento prístroj zobrazuje hodnoty absorbancie, ktorá udáva aké množstvo svetla bolo pohltené vzorkou. Teda čím väčšia hodnota, tým viac baktérií.

Urobíte jeden pokus s jednou baktériou, potom druhý pokus s druhou baktériou a zistíte, že vám jedna z nich pri 8HQ rastie krásne bez akejkoľvek zmeny, ale tá druhá prestáva rásť. Potom ich skúsite zmiešať a pokus zopakovať. Tu ale nastane problém: ako potvrdíte, že jedna z nich prerástla tú druhú? A čo ak rastú obidve rovnako dobre? Úplne teoreticky by v prítomnosti 8HQ jedna druhej mohla pomáhať rásť. Takéto javy sa v prírode vyskytujú.  

Jasné, metód na objasnenie tejto otázky je veľa, ale jedna z možností je hybridizácia ribozomálneho génu 16S rDNA. Už sme si vysvetľovali v predchádzajúcich blogoch, že gén, ktorý slúži ako identifikačný preukaz baktérií sa volá 16S. Baktéria má veľa kópií ribozomálnej RNA, takže je to dobrý cieľ. V špecializovaných firmách je možné nechať si nasyntetizovať krátke úseky jednoreťazcovej DNA, ktorá sa naviaže na RNA v bakteriálnej bunke. Volá sa to sonda. Ak sa sonda naviaže na kompatibilný úsek RNA, rozosvieti sa. Môžeme si dokonca vybrať, v akej farbe bude svietiť. Nechali sme si teda vyrobiť špeciálnu sondu pre Bifidobacterium longum subsp. longum svietiacu na oranžovo a pre Clostridium difficile svietiacu na zeleno. Tak vám do laboratória prijde obálka a v nej malá tubička, v ktorej je akýsi farbený roztok. V nej pláve mnoho kópií 20-nukleotidových úsekov jednoreťazcovej DNA s pripojenou svietiacou časťou podľa vašej objednávky.

Najprv musíme aplikovať laboratórny protokol na fixáciu baktérií, kde vlastne zastavíme ich rast a zároveň zakonzervujeme ich RNA v takom stave, v akom bola v momente pridania formaldehydu. Na to nám stačí naozaj málinko baktérii, ich objem môže byť aj menší než malinká kvapka vody. V našom pokuse sme sa rozhodli, že zo zmiešanej kultúry bifidobacteria s clostridiom budeme odoberať vzorky každé dve hodiny. A to pre dva typy pokusov: v jednom rástli baktérie v obyčajnom médiu a do druhého sme pridali vopred vypočítanú koncentráciu 8HQ. Okrem toho sme si ako kontroly pripravili osobitnú kultúru čistého bifidobakteria a vedľa toho samostatnú čistého clostridia. Obidva kontrolné pokusy boli tiež v médiu bez 8HQ a v médiu s 8HQ. Takže každé dve hodiny sme odoberali vzorky a hneď s nimi šup do formaldehydu. Na začiatku nebolo vidieť skoro žiadne baktérie, ale pár stoviek baktérii nám na pokus stačí. Po pár hodinách už baktérie narástli tak, že sme tam aj okom mohli sledovať zakalenie.

Potom sme formladehyd nechali pôsobiť niekoľko hodín a nakoniec ho odmyli. Kedže sme vlastne každé dve hodiny odoberali 6 vzoriek (zmiešané B+C, čisté B, čisté C - všetky boli buď s  8HQ a bez 8HQ), na konci pokusu sme už mali peknú zbierku mikrotubičiek, takže sa bolo treba pekne sústrediť. Pridali sme enzým lysozým, ktorý trochu naruší šturktúru bunkovej steny baktérie,čo umožní sonde pekne preniknúť do vnútra bunky a pripojiť sa na to správne miesto na RNA. To je kritický bod, lebo ak necháte tento enzým pôsobiť veľmi dlho, baktérie sa vám úplne rozpustia.

Potom pridáme do každej tuby mix chemických látok, ktoré vytvárajú jemnú penu (podobne ako prostriedok na umývanie riadu), ktoré tiež pomôžu sonde dostať sa dnu do bunky. Nesmieme zabudnúť aj na negatívnu kontrolu, kde k baktériám nepridáme žiadnu svetelnú sondu, ale spracovávame ju tak, ako všetky ostatné vzorky. Lepšie je ešte urobiť si ešte prísnejšiiu kontrolu, kde do jednej vzorky pridáme sondu, ktorá má poradie nukleotidov naopak, takže sa na RNA neprilepí. Sonda, ktorej bolo nadbytok, alebo ktorá sa nemala kam pripojiť, sa odmyla. Napríklad v prípade čistej kultúry bifidobaktéria by sa mala odmyť všetká sonda navrhnutá pre clostrídium, lebo v RNA bifidobaktéria sa nenachádza žiaden kompatibilný úsek.

Potom sme išli s týmito všetkými vzorkami na prietokový cytometer, ktorý každú jednu baktériu akoby preskenuje (tiež som o ňom písala už dávnejšie) dvoma typmi laserov. Jedným laserom sa baktérie rozosvietia na oranžovo a druhým na zeleno. Ak sa v baktérii nenechádzajú žiadne sondy prilepené k RNA svietiace na zeleno, tak bunka pod daným laserom na zeleno svietiť nebude. Cytometer teda spočíta, koľko máme vo vzorke baktérií svietiacich na oranžovo (Bifidobacterium) a koľko na zeleno (Clostridium).

Tak sa nám podarilo potvrdiť, že látka 8HQ má selektívny antibakteriálny účinok aj v zmiešanej kultúre, naozaj rástlo len Bifidobacterium.

Potom sme ešte skúmali aktivitu buniek počas rastu v médiu s 8HQ a bez 8HQ. Tiež druhá naša stážistka Šárka skúmala rast bifidobacteria na rôznych zložkách mlieka. Ale o tom až nabudúce.

Páčil sa Vám tento článok? Pridajte si blogera medzi obľúbených a my Vám pošleme email keď napíše ďalší článok
Pridaj k obľúbeným

Hlavné správy

KOMENTÁRE

Van der Bellen nevyhral, to len populizmus porazil sám seba

Miloš Zeman sa tešil predčasne. Ukazuje sa, že víťazstvá radikálov či populistov nie sú ani v dnešnej dobe samozrejmosťou.

KOMENTÁRE

Renzi dal sám sebe mat. Dostala ho aj Európa?

Taliansky výsledok je politicky nepomerne ďalekonosnejší než rakúsky.

SVET

Taliansky premiér Renzi po prehre v referende podá demisiu

Hlasovanie zaznamenalo vysokú účasť.


Už ste čítali?