Ako rastú baktérie

Autor: Mária Džunková | 15.11.2014 o 1:15 | (upravené 15.11.2014 o 1:23) Karma článku: 5,37 | Prečítané:  1031x

Prietokový cytometer nám umožňuje vidieť, ktoré baktérie z kultivačného média boli v danom momente aktívne a ktoré práve zomierali. To je detail, ktorý sa pri sledovaní rastovej krivky pomocou absorbancie nedá vidieť. V našom článku, ktorý nedávno vyšiel v Journal of Medical Microbiology sme porovnávali rast Clostridium difficile a Bifidobacterium longum subsp. longum na médiu s rastlinným alkaloidom 8-hydroxyquinoline (8HQ) a bez neho.

Bakteriálne kolónie na Petriho miske sú také malé bodky, ktoré vyrastajú zo stuhnutého agaru s potrebnými výživnými látkami. Bakteriálna kolónia sa vytvorí tak, že jedna jediná baktéria (viditeľná len pod mikroskopom) sa počas niekoľkých hodín rozmnoží toľkokrát, že už tieto baktérie vidíme voľným okom ako bielu bodku. Ak jednu takúto kolóniu vypichneme špáratkom a prenesieme ju do tekutého média s tým istým výživným zložením ako predtým na Petriho miske, tak sa nám baktérie po čase rozrastú tak, že sa tekuté výživné médium zakalí.

Z tohoto média budeme odoberať vzorky povedzme každú hodinu a odhadneme koncentráciu baktérii meraním absorbancie (po anglicky optical density - OD). Prístroj odmeria, koľko svetla vzorka pohlcuje, takže ako sa počet baktérií zvyšuje, tak sa zvyšuje aj číslo, ktoré nám dá tento prístroj. Počas prvých hodín bude táto hodnota rovná skoro nule, ale po niekoľkých hodinách príde zrazu zlom a táto bakteriálna populácia sa začne exponenciálne množiť. V exponenciálnej fáze sa napríklad jedna jediná baktéria Escherichia coli dokáže rozdeliť na dve len za 20 minút. Ale baktérie sa však nebudú množiť exponenciálne do nekonečna. Ak ich už bude v kultivačnej banke príliš veľa, vyčerpajú všetky živiny a začnú zomierať. Ale aj v tejto poslednej fáze stále aj po niekolkých hodinách môžeme objaviť ešte nejaké baktérie, ktoré sú živé a delia sa.

Ak chcete vidieť pekné časozberné video, ako sa delia baktérie pod mikroskopom, kliknite tu. Je tam vidieť, ako baktéria najprv rastie do dĺžky a potom sa rozdelí na dve. Čas 20 minút na delenie platí však len pre druh E. coli v úplne priaznivých podmienkach. Každý druh baktérií to má iné. A v zlých podmienkach môže trvať aj dlhé hodiny. Za týchto 20 minút baktéria rýchlo nasyntetizuje všetko potrebné, rozrastie sa do dĺžky a rozdelí sa na dve. To znamená, že v istom momente bude mať nielen dvojnásobnú veľkosť, ale aj dve kópie celej svojej DNA. Potom “prásk” a dvojitá baktéria sa rozdelí na dve.

Nasledujúci graf sa mi veľmi páči, lebo ako jeden z mála zobrazuje ako príklad aj skúmavku, kde je približný pomer živých a mŕtvych baktérií. Na tomto obrázku je ale nakreslené, že sa baktérie v médiu dostanú do poslednej fázy (death phase) už po piatich hodinách, v prípade E. coli pochádzajúcej z jednej kolónie to môže byť okolo 20 hodín aj viac. Závisí to od veľa faktorov, samozrejme od druhu baktérie, zloženia a objemu média ale aj od toho, koľko buniek sme do média vlastne preniesli.
 

Ako hovorí obrázok, v jednom momente máme v odobratej vzorke aj mŕtve aj živé baktérie. Ale keď meriame len obyčajnú absorbanciu svetla, údaj o ich aktivite nedostaneme. Hodnota absorbancie bude rovnaká pre vzorku, kde sa nachádza 10 % mŕtvych  + 90 % živých baktérii ako aj pre vzorku kde je  90% mŕtvych a 10% živých.

Zaujímavé sú prvé hodiny po tom, čo kolóniu prenesieme do tekutého média - takzvaná lag fáza. Vtedy sa baktérie ešte exponenciálne nemnožia a hodnoty absorbancie počas týchto hodín sú rovné skoro nule. Predpokladalo sa, že lag fáza je čas, ktorý potrebujú baktérie na to, aby sa spamätali zo šoku, ktorý im spôsobuje transfer z Petriho misky do tekutého média. Nedávno som čítala jeden zaujímavý článok, kde sa detailne vysvetľuje, čo sa s baktériami deje, keď sú v lag fáze. Nedelia sa, len sa predlžujú. Spomínaný šok netrvá dlhé hodiny, ale len pár minút. Baktérie hneď začnú syntetizovať enzýmy a spracovávať výživné látky a stopové prvky z média. V tom článku merali expresiu jednotlivých génov a zistili, že lag fáza má vlastne akoby podfázy a v každej z nich sa baktérie zameriavajú na spracovávanie iných látok.
 
V našom laboratóriu radi farbíme baktérie. V minulom blogu som vám vysvetlila, ako sme zafarbili Clostridium difficile na zeleno a Bifidobacterium longum subsp. longum na oranžovo, aby sme ich odlíšili v zmiešanej kultúre. Farbili sme ich špecifické sekvencie RNA génu zvaného 16S, ktorý funguje ako identifikačńý preukaz pre každý druh baktérie. Na prietokovom cytometri sme spočítali, koľko buniek v zmiešanej kultúre patrí Clostridiu a koľko Bifidobacteriu.

Existujú však aj techniky, kde sa nefarbia baktérie podľa druhu, ale v každej baktérií sa zafarbí buď RNA (na oranžovo) alebo DNA (na červeno). V momente, keď sa baktéria delí na dve, teda je dvojitá, obsahuje dvojnásobné množstvo DNA a bunka je väčšia. Prietokový cytometer nám umožňuje triediť baktérie podľa ich veľkosti a fluorescencie. Baktéria, ktorá má v danom momente dve kópie DNA, bude svietiť dvakrát viac než normálna baktéria. Ak si cytometrom necháme zobraziť veľkosť bunky na jednej osi a fluorescenciu na druhej, budeme vidieť akoby dva obláčiky, jeden vľavo dole (malé bunky, málo fluorescencie) a druhý vpravo hore (veľké bunky, dvojitá fluorescencia - dvakrát viac DNA). To sa dá krásne sledovať v bode, keď sa bunky dostávajú z lag fázy do exponenciálnej fázy. Potom v exponenciálnej fáze je bunkové delenie tak rýchle a buniek je už tak veľa, že je ťažko vidieť nejaké rozdiely, ak robíme meranie každú hodinu.

Množstvo RNA v bunke nám hovorí niečo o jej aktivite. Podobné obrazce ako s DNA farbivom sa dajú počas prvých hodín rastovej krivky pozorovať aj v prípade RNA. Čím je baktéria aktívnejšia, teda že syntetizuje proteiny, spracováva výživné látky, tým má viac RNA a bude svietiť viac. Je to zaujímavé, pretože ak porovnávame rast s antibiotikom a bez neho, ako v našom článku o 8HQ, o ktorom som podrobnejšie písala minule, môžeme pozorovať, aké problémy s antibiotikom citlivá baktéria má. Naozaj umiera alebo sa len snaží nevhodné problémy prekonať syntetizovaním nejakých látok, čo je pre ňu väčšia námaha, a preto rastie pomalšie? To sa odrazí na množstve RNA, a teda fluorescencii.

Načo sú dobré takéto zábavky s farbením a počítaním baktérií? Prietoková cytometria nám umožňuje pozorovať baktérie jednu po druhej, neštudujeme ich ako celok. Stáva sa, že baktérie získajú určitú mutáciu, ktorá im umožňuje rásť rýchlejšie a v skutočnosti máme takto v kultivačnom médiu nehomogénnu populáciu, ktorú meraním absorbancie nikdy neodhalíme. Dokonca môže nastať aj prípad, že sa v médiu s antibiotikom medzi citlivými baktériami zrazu objaví jedna jediná baktéria, ktorá zmutovala a je už rezistentná a rozrastie sa do väčšej populácie. Tu prichádza ďalší krok, ktorý už celkom dobre ovlávame, a to vyseparovanie tejto baktérie a osekvenovanie jej genómu. Takto by sme mohli zistiť aké nové rezistentné gény má. Alebo skúmanie génov, ktoré práve prepisuje do RNA, tak by sme presne vedeli, čím sa táto bakteriálna populácia odlišuje od pôvodnej populácie aké gény potrebuje na to, aby rástla rýchlejšie/prežila.

Páčil sa Vám tento článok? Pridajte si blogera medzi obľúbených a my Vám pošleme email keď napíše ďalší článok
Pridaj k obľúbeným

Hlavné správy

KOMENTÁRE

Van der Bellen nevyhral, to len populizmus porazil sám seba

Miloš Zeman sa tešil predčasne. Ukazuje sa, že víťazstvá radikálov či populistov nie sú ani v dnešnej dobe samozrejmosťou.

KOMENTÁRE

Renzi dal sám sebe mat. Dostala ho aj Európa?

Taliansky výsledok je politicky nepomerne ďalekonosnejší než rakúsky.

SVET

Taliansky premiér Renzi po prehre v referende podá demisiu

Hlasovanie zaznamenalo vysokú účasť.


Už ste čítali?