Vo všetkých variantách, ktoré vám tu predstavím, by sme začínali extrakciou DNA. Dali by ste nám napríklad niekoľko buniek jednoduchým zoškrabnutím z vnútornej strany úst. Z týchto buniek by sme pekne v skúmavke vyextrahovali DNA. Robí sa to pôsobením rôznych chemických látok a enzýmov, ktoré postupne rozložia všetky bunkové štruktúry. Ďalšie chemické látky a centrifugácia odstránia všetky rozložené bielkoviny, tuky a všetko ostatné, čo bolo v bunke a dostaneme len čistú DNA, ktorú v poslednej fáze tohoto postupu môžeme pozorovať ako bielu malilinkú usadeninu na spodku skúmavky, ktorá sa nakoniec rozpustí vo vode a buď hneď spracuje alebo odloží do mrazáku.
Začnime teda s najlacnejšou verziou, čiže spoznať sekvenciu nejakého kúsočku DNA. Výsledkom by bola sekvencia o dĺžke nejakých 500-3000 písmeniek (nukleotidov), o ktorej by ste si mohli povedať: "Toto je kúsoček z môjho genetického kódu." Nemusí to ale znamenať, že tento kúsoček je spomedzi všetkých ľudí na svete jedinečný len pre vás, pretože by sa jednalo len o jeden jediný kratučký úsek z celého genómu človeka, ktorý je 3 200 000 000 písmen. Vybrali by sme nejaký gén alebo variabilný úsek, ktorý by vás zaujímal. Kedže je už celý ľudský genóm známy a mnohé jeho časti dostatočne preskúmané, vybrali by sme nejaký známejší úsek, na ktorý sú už navrhnuté primery [prajmery], s ktorými by sme urobili reakciu PCR. Primery sú krátke sekvencie nukleotidov (cca 20 písmen), ktoré si môžeme nechať pripraviť špecializavými firmami, ktoré ich dokážu "vytlačiť" podľa našej objednávky. Úsek DNA, ktorý by nás zaujímal, by sa mal vyznačovať tým, že je dosť variabilný medzi jedincami, ale vie sa, že na jeho konci a začiatku sú určité písmenká, ktoré tam v každom prípade budú zakonzervované.
Reakciu PCR som na mojich predchádzajúcich blogoch spomínala už niekoľkokrát, ale teraz nastal čas vysvetliť to poriadne. Je to reakcia, pri ktorej sa namnoží len ten neznámy úsek medzi dvoma primermi. Robí to enzým polymeráza, ktorý sa normálne nachádza v prírode. Vedci zistili, že tento enzým dokáže pripájať k reťazcu DNA presne podľa jeho kódu komplementárne písmenká, ktoré pridáme do skúmavky. (Komplementárne znamená, že tam, kde je A sa pripojí T, tam, kde je C sa pripojí G a naopak.) Pôsobením rôznych teplôt v opakujúcich sa cykloch docielime, že sa nám želaný kúsoček DNA namnoží niekoľko miliónov krát, zatiaľ čo celá originálna dlhá DNA ostáva len v jednej kópií. To som sa znažila zobraziť na tomto veľkom obrázku v článku, kde som namaľovala zblízka, čo sa deje s tým kúsočkom DNA v skúmavke pri reakcii PCR.
Prebieha to tak, že do skúmavky, kde máme našu vyextrahovanú DNA pekne v celej dĺžke, pridáme veľké množstvo tých primerov a ešte viac voľných písmeniek (nukleotidov) a enzým polymerázu. Najprv je DNA normálne v dvoch komplementárnych reťazcoch (1), ktoré sú spojené (na obrázku modrou a červenou farbou), ale keď na ňu budeme pôsobiť vysokou teplotou (napr. 95°C), tak sa tieto dva reťazce oddelia (2). Keď teplotu znížime, tak dovolíme primerom (tým umelo vyrobeným úsekom DNA o dĺžke nejakých cca 20 nukleotidov), aby sa pripojili na oddelené reťazce, ku ktorým sú komplementárne (3). Enzým polymeráza dokáže dorobiť chýbajúci úsek komplementárnej DNA, ktorý nasleduje po primere. Robí to tak, že prilepuje komplementárne písmenká, ktoré plávu v skúmavke, v poradí podľa originálneho reťazca DNA (4). Takto sa dorobí druhý reťazec DNA až do jeho konca (maximálna dĺžka sa môže regulovať aj zmenami podmienok reakcie). Druhé kolo množenia DNA začína zase zvýšením teploty na 95°C, kedy sa všetky dvojice reťazcov oddelia (5). Zase znížime teplotu, a tak dovolíme primerom, aby sa znovu pripojili na miesta na reťazcoch DNA, ku ktorým sú komplementárne(6). Zase začne pôsobiť enzým polymeráza a dotvorí komplementrárny reťazec (7), ktorý sa zase v ďalšom kole pri teplote 95°C od svojho komplemntárneho reťazca oddelí, aby mohli primery a polymeráza znovu pracovať (8). Všimnite si ale teraz na obrázku, že tam máme 8 jednoreťazcových molekúl DNA, z čoho sú 2 tie pôvodné dlhokánske reťazce, 4 sú polodhé a 2 sú veľmi krátke, ktoré presne siahajú od jedného primera k druhému, čo je ten úsek, ktorý nás zaujíma. V krokoch 9 a 10 na obrázku bude zase prebiehať to isté, ale zostanú len 2 pôvodne dlhé reťazce a 4 polodlhé, ale počet tých kratučkých úsekov sa bude každým cyklom zvyšovať. Ak toto zopakujeme napríklad 25 krát, dostaneme 2na25, teda 33 554 432 krátkych kúsočkov, pričom pôvodná dlhá DNA zostane len jedna.
Z toho celého si stačí zapamätať, že reakcia PCR slúži na vytvorenie niekoľko miliónov kópií úseku DNA, ktorý nás zaujíma a pomáha nám odhaliť sekvenciu, ktorá sa nachádza v tomto variabilnom úseku medzi dvoma primermi. Túto reakciu určite využívajú aj pri testoch otcovstva, takže keď budete niekedy v živote takéto testy potrebovať, tak aspoň budete mať predstavu, ako sa dospeje k výsledkom.
Takto namnoženú DNA môžeme napríklad zobraziť na agarózovom géle pod UV svetlom a porovnať dve vzorky, či majú rovnako dlhé úseky alebo či nejaký úsek v jednej vzorke chýba a v druhej je naviac.
Na to ale, aby sme vedeli, akú sekvenciu tento úsek má, ju musíme osekvenovať. Pripravili by sme sekvenačnú reakciu a strčili do sekvenátora a výsledok by bol za pár hodín. Ak by sme okrem vašej vzorky spracovali naraz ešte niekoľko ďalších, náklady by sa znížili a dovolím si odhadnúť, že získať jednu vašu sekvenciu v takejto forme by stálo tak maximálne 20 eur.
Ak by ste chceli spoznať viac vašich sekvencií, mohli by sme vašu vyextrahovanú DNA spracovať jedným z kitov (súbor chemikálií a príslušenstva), ktoré sú vymyslené tak, že dokážu teoreticky zachytiť až 64 000 000 sekvencií z niekoľko stoviek génov naraz a pritom sekvencie, ktoré nekódujú žiadne gény, vynechávajú. Získané sekvencie naraz pripravíme do sekvenátora a behom pár dní by ste dostali niekoľko tisíc svojich génov. To by už bolo oveľa zaujímavejšie. Cenu neviem presne odhadnúť, pretože je veľa firiem, ktoré ponúkajú takéto kity, ale určite by však začínala niekde na 4000 eurách.
Táto možnosť má ešte druhú variantu, kde by ste získali niekoľko tisíc sekvencií naraz, medzi nimi aj sekvencie, ktoré nekódujú žiadne gény. V tomto prípade by sa vyextrahovaná DNA rovno nasekala na kúsky a pripravila sa do sekvenátora. Sekvenovalo by sa množstvo sekvencií podľa vášho želania, v každom prípade by sme tiež začínali na hranici niekoľkých tisícov eur.
To sa ale nedá ani porovnať s tým, koľko stálo pripravenie prvého ľudského genómu. Projekt začal v roku 1990, dokončeý bol vraj v roku 2003, ale stále sa publikujú ešte nejaké nové zistenia. Stál skoro 3 miliardy dolárov. Prebiehalo to podobne ako som vám popísala v blogu o sekvenovaní pšenice. Ak by ste sa rozhodli nechať si teraz osekvenovať váš celý genóm, v dnešnej dobe by to už bolo lacnejšie. Nemuseli by vám ho už sekvenovať do takej hĺbky, ako to urobili v prípade toho prvého. Sekvencia tohoto prvého genómu by poslúžila na poskladanie sekvencií toho vášho, pretože by si boli dosť podobné. Cena nákladov na sekvenovanie stále klesá. V roku 2008 sa začalo v USA ponúkať sekvenovanie genómov súkromným osobám a jeden genóm stál už len 2 milióny dolárov. Mnoho sa hovorí o tom, že cieľ by bol sekvenovanie vylepšiť a zlacniť tak, aby sa genóm jedného človeka mohol osekvenovať za 1000 dolárov. V prípade sekvenovania takých dôležitých údajov ako ľudská DNA by však na prvom mieste nemala byť cena, ale presnosť, pretože za mnohé choroby zodpovedá len jediná zámena písmenok v genóme (SNPs - single nucleotide polymorphism), pretože väčšie množstvo sekvencií nám pomôže pokryť celý genóm niekoľkokrát, a tak budeme istejší, či sa tam tá zmena naozaj vyskytla. Našťasie, v dnešnej dobe, nezávisle na tom, koľko by teoreticky stálo sekvenovanie celého genómu, sme už schopní identifikovať niektoré choroby len jendoducho vďaka reakcii PCR, ktorá je neporovnateľne lacnejšia, pretože namnoží len ten úsek DNA, ktorý nás zaujíma. Táto technika sa našťastie už pomaly dostáva aj do mnohých nemocníc a pôrodníc a pomohla už množstvu ľudí.
